分光光度计原理

分光光度计原理
分光光度计是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。分光光度计是电子引进根据电磁辐射原理，不同的物质具有不同的选择吸收，也即具有不同的吸收光谱。分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。


许多化学物质具有颜色，有些无颜色的化合物也可以与显色剂作用，生成有色物质。实践证明，有色溶液的浓度越大，颜色越深；浓度越小，颜色越浅。因此，可以通过比较溶液颜色深浅的方法来确定有色溶液的浓度，对溶液中所含的物质进行定量分析。基于比较颜色深浅对溶液进行定量分析的方法称为比色分析法。 


分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。常用的波长范围为：
(1)200～400nm的紫外光区；
(2)400～760nm的可见光区；
(3)2.5～25μm（按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>）的红外光区。


所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。


包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200～400 nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.
钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱光通过三棱镜折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.
氢灯（或氘灯）的发射光谱:氢灯能发出185～400 nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源.
物质的吸收光谱
如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.
不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.
物质的吸收光谱
当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液.
入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透过光
如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失则:
入射光 = 吸收光 十 透过光


分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 为吸光度；
I。为入射的单色光强度；
I 为透射的单色光强度；
T 为物质的透射率；
k 为摩尔吸收系数；
L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长
c 为物质的浓度
物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。


溶液为什么会有颜色，颜色又为什么与浓度有关呢？下面就讨论这个问题。
    一、光的互补及有色物质的显色原理
    1．光的波粒二象性
光是能的一种表现形式，是电磁波的一种。光在真空中以直线方式传播，在不同的介质处发生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等现象。可用波长、频率、传播速度等参量来描述，即光具有“波动性”。光的颜色即由光的波长决定，人眼能感觉到的光称为可见光，其波长在400～750nrn之间。在可见光之外是红外光和紫外光。同时，光也具有“粒子性”，光电效应就是一个很好的例子。光的粒子性理论认为，光是由“光子”（或称“光量子”）所组成。在辐射能量时，光是以一份一份的能量E的形式辐射的，同时光被吸收时，能量也是一份一份被吸收的。这每一份能量的大小为hυ。光子的能量与波长的关系为E=hυ= hc／λ，式中E为光子的能量（J：焦耳），υ为频率，h为普朗克常数（6.63×10-34J?S），c为光速，λ为光的波长。因此，不同波长的光，其能量不同，短波能量大，长波能量小。
    2。光的显色原理
    若把某两种颜色的光，按一定的强度比例混合，能够得到白色光，则这两种颜色的光叫做互补色。图1中处于直线关系的两种光为互补色。如绿光和紫光为互补色，黄光和蓝光为互补色等等。
各种溶液会呈现出不同的颜色，其原因是溶液中有色质点（分子或离子）选择性地吸收某种颜色的光。实验证明：溶液所呈现的颜色是其主要吸收光的互补色。如一束白光通过高锰酸钾溶液时，绿光大部分被选择吸收，其它的光透过溶液。从互补色示意图可以看出，透过光中只剩下紫色光，所以高锰酸钾溶液呈紫色。

二、朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律
溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可以用吸收定律来描述。它是由朗伯定律和比尔定律相结合而成的，所以叫朗伯-比尔定律。原子吸收分光光度计也符合这个定律。
溶液对光的吸收   当一束强度为I的平行单色光照到溶液时，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光则透过溶液，如图2所示

有：I0=Ia+ Ir+ It
I0--入射光强度
Ia--吸收光强度
Ir--反射光强度
It--透射光强度
通常由于Ir很小可忽略不计，上式可简化为 
I0=Ia+ It
透射光It与入射光强度I0之比为透光率或透光度，用T表示：
T= It/ Ia
透光率的负对数称为吸光度或光密度或消光度，用A表示：
A=－lgT=lg1/T=lgIa/ It
吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来表示入射光被吸收的程度，它们之间可据式相互换算。
实验证明，单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。其规律可用下式表示为A＝KCL式中：A（E）——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；K——某溶液的消光（吸收）系数；C——溶液的浓度；L——光程，即溶液的厚度。


   消光系数K是一个常数。一种有色溶液对于一定波长（单色光）的入射光的K值具有一定的数值。若溶液的浓度以摩尔／升表示，溶液厚度以厘米表示，则此时的K值称为摩尔消光系数。摩尔消光系数是有色化合物的重要特性之一，根据这个数值的大小，可以估计显色反应的灵敏程度。
   从上式可以看出，当K和L不变时，光密度E与溶液浓度C成正比关系，也可以说，当一束单色入射光经过有色溶液且入射光、消光系数和溶液厚度不变时，吸光度A是随着溶液浓度而变化的。


   这种单色光与有色溶液的关系称为朗伯-比尔定律。光电比色计和分光光度计的比色分析方法就是根据这一定律来进行的。但是，朗伯-比尔定律只适用于单色光和低浓度的有色溶液。
    三、朗伯-比尔定律的应用
    1．等吸光度法
    从朗伯-比耳定律可知，当用同一光源照射同一物质的不同浓度溶液时，若吸光度相等，则两溶液各自的浓度和透光液层厚度的乘积也相等。利用此关系在可见光区用眼作检测器（目视比色法），即可求出待测溶液的浓度。


   2．计算法
    根据被测溶液浓度的大致范围，先配制一已知浓度的标准溶液。用同样的方法处理标准溶液与被测溶液，使其成色后，在同样的实验条件下用同一台仪器分别测定它们的吸光度。
    在标准溶液中：As=KsCsLs
    在待测溶液中：Ax=KxCxLx
    如果测定时选用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波长的单色光，保持温度相同，则K也相等。将两式相除可得As/ Ax=Cs/Cx
    由此可见，在满足上述条件下，吸光度与溶液成正比。如果设计一种仪器，可以测量吸光度A值，则待测溶液的浓度即可求出 Cx=Ax/ As? Cs
    由于仪器的性能和实验环境在不断的变化，所以在采用计算法时，必须每次都要对标准液和被测液进行测量，然后利用上式进行计算，否则会带来较大的测量误差。
    由于一般光电比色计在结构上有不少偏离朗伯一比耳定律的地方，故欲得到较准确的结果，常采用标准曲线法。


  3．标准曲线法
    这种方法分以下几步：
    （1）先配制五种以上标准浓度的溶液。
    （2）测出每种溶液的吸光度A。
（3）做A～C标准曲线图，如图3所示。
    有了标准工作曲线便可对溶液进行测量。在同样的条件下，用仪器测出A后，查标准曲线即可得被测溶液的浓度值Cx。

由于光电比色计工作在可见光区，只适合在有限个波长下测量，且波长的半宽度大。因此，它不能满足不同分析工作的需要。其次，光电比色计的灵敏度也低。为了克服以上不足，便发展了性能更好的分析方法：紫外--分光光度法。它利用单色器分光，其单色光纯度高，波长范围宽，并可连续变化，解决了光电比色计存在的问题。